L’Ordre resta alors sans territoire pendant plusieurs années jusqu’à ce qu’en 1530, le Grand Maître Fra’ Philippe de Villiers de l’Isle Adam prenne possession de l’île de Malte, cédée à l’Ordre par l’Empereur Charles Quint avec la bénédiction du Pape Clément VII. Il fut établi que l’Ordre resterait neutre dans les guerres entre pays chrétiens.
En 1565, les Chevaliers, conduits par le Grand Maître Fra’ Jean de la Vallette défendirent l’île pendant le long siège des Ottomans qui dura plus de trois mois.
À la suite de cette victoire la ville et le port de la Vallette sont construits; celui-ci prend le nom du Grand Maître, son fondateur. Les cavaliers transforment Malte avec d’importants projets de construction urbaine: des palais et des églises sont construit, ainsi que de nouvelles fortifications et jardins formidables. L’architecture et le mécénat artistique fleurissent.
Un nouveau grand hôpital est construit sur l’île, considéré comme l’un des mieux organisés et plus efficaces au monde. Une école d’anatomie est fondée, suivie par la faculté de médecine. L’Ordre contribue en particulier au développement de l’ophtalmologie et de pharmacologie.
En plus de ces activités, la flotte de l’Ordre de Malte prendra part pendant des siècles aux manœuvres les plus importantes de la Méditerranée contre la marine ottomane et les pirates d’Afrique du Nord.
